Методическое пособие
Протеомные исследования в биологии и медицине
План:
Введение
Протеомика в биологии
Протеомика в медицине
Заключение, перспективы
Введение
Термин «протеом», обозначает весь белковый комплемент, экспрессируемый геномом – “PROTEOME: entire PROTEin complement expressed by genOME”. Протеомика – это системное изучение «протеома», то есть всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме). Высокая значимость каждого из индивидуальных белков для обеспечения тех или иных функций и/или молекулярных структур в организме не только определяет их вовлеченность в различные физиологические и патологические процессы с потенциальными возможностями для использования белков в качестве эффективных диагностических маркеров, но и для применения некоторых белков как лекарственных средств. Для обнаружения и исследований новых белков широко применяются новые технологии , которые после завершения международного проекта «Геном человека» принято называть постгеномными. В частности, для системных исследований информационных РНК (транскриптов) используют термин «транскриптомика», а для системных исследований белков – «протеомика». Освоение и использование геномных и постгеномных технологий позволяет вывести молекулярно-биологические исследования, направленные на решение медицинских вопросов, на качественно более высокий уровень.
Традиционные подходы к изучению индивидуальных белков – биохимический и иммунохимический ориентируются на последовательное изучение отдельных белков. Для достижения цели белки изучают (выделяют), используя их индивидуальные свойства – функциональную активность или антигенность . В тоже время, системный подход ориентируется на параллельное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Рисунок 1 демонстрирует различие в разрешающей способности между одномерным электрофорезом (разделение смеси белков по разнице в их молекулярных массах) и комплексным методом – двумерным электрофорезом. Двумерный электрофорез в состоянии выявить в несколько раз больше индивидуальных белков, по сравнению с одномерным.
53" height="32" style="vertical-align:top">
Рис. 1. Сравнение результатов одномерного (А) и двумерного (Б) форезов мембранных белков эритроцитов человека. Результат: одномерный форез выявил около 30, а двумерный – 189 белков.
История
В 20 веке методы аналитической химии прогрессировали от простых процедур, имеющих дело с единичными элементами, к более сложным методам, основанным на физическом разделении и детекции веществ. Таким образом, уже более 50 лет назад большое внимание уделялось методам разделения частиц – хроматографии, электрофорезу, масс-спектрометрии. Несколько позднее изобрели капиллярный электрофорез (гг.). Из всех этих методов только масс-спектрометрия обеспечивала разрешение, достаточное для разделения и идентификации сложных элементных смесей, однако до недавнего времени, и она не могла адекватно разделять макромолекулы. Задавшись целью увеличить разделительную способность, ученые пришли к выводу о необходимости совместить в двух измерениях два каких-либо метода, основанных на измерении разных параметров. Изначально предлагалось использовать два различных растворителя при разделении молекул в процессе хроматографии на бумаге, а также предпринимались попытки совместить электрофорез, в качестве первого направления с хроматографией, в качестве другого. Эта же концепция также имела место при разделении молекул по седиментационным коэффициентам и по различиям в плотности при ультрацентрифугировании. Если два метода разделения независимы друг от друга, то финальное разрешение должно определяться суммой разрешения обоих методов. В принципе, можно было бы добавить более двух измерений, однако такой подход может привести к значительному падению концентрации исследуемого вещества и к возникновению проблем в детекции сигнала.
По крайней мере шесть независимых попыток разработать двумерный электрофоретический метод было предпринято, прежде чем в 1975-76 гг. была опубликована первая доступная весия метода, объединяющая изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в растворах мочевины с электрофорезом в присутствии йонного детергента додецилсульфата Na (SDS). Разделение проводилось по первому направлению на основе заряда денатурированных белков (зависит от аминокислотной последовательности), а по второму направлению – в зависимости от молекулярной массы (см. раздел Методы).
В течение прошедших с тех пор 30 лет метод подвергался многим дополнениям, в частности, была предложена идентификация разделенных белков с помощью микросеквенирования и масс спектрометрии. Создаются компьютерные базы данных , содержащие сведения о клетках в культуре, белках плазмы крови, белках печени мыши и крысы, E. Coli, дрожжей и других модельных объектах. Практическое расширение области используемых pH связано с использованием коммерческих наборов иммобилинов, то есть иммобилизованных на специальных стрипах амфолинов. Использование таких наборов увеличивает воспроизводимость и увеличивает область действия метода. Иммобилиновая система позволяет использовать значительные нагрузки по белку: 1-10 мг на полоску (обычная нагрузка составляет около 100 мкг белка) и обеспечивает возможность изучения белков с рН > 8,5.
2Д электрофорез заложил основу для расшифровки молекулярного строения человеческих и животных тканей, клеток, бактерий и вирусов и для детектции изменений, происходящих при развитии, старении, заболеваниях а также в ответ на изменения окружающей среды. Протеомные методы используются для определения маркеров заболеваний и разработки новых лекарств. Также комбинация 2Д электрофореза с фракционированием клеточных органелл может дать информацию о внутриклеточной локализации специфических белков. Метод должен отличаться воспроизводимостью и возможностью количественной оценки результатов. В идеальном случае, должна быть возможность автоматизации всего набора процедур. До сих пор не существует полностью автоматизированного 2Д электрофореза, в связи с тем, что процедуры, входящие в него очень трудоемки.
Интересный аспект истории 2Д электрофореза показан на рис. 2, представляюшем число публикаций, найденных по запросу: 2Д электрофорез и протеомика. В последние 10 лет число статей, посвященных 2Д электрофорезу стабилизировалось и вышло на плато. С чем это связано - с тем, что 2Д электрофорез выходит из моды? Или это объясняется теми успехами секвенирования генома, которые наблюдаются в последние годы? Однако, даже если представить себе полностью расшифрованные геномы всех без исключения живых существ, протеомика будет иметь право на существование, так как связывает продукты деятельности генов с функциями организма. В последние несколько лет термин «протеомика» очень часто встречается среди цитируемых статей (рис. 2)
Рис. 2. Число публикаций, посвященных 2Д электрофорезу (2D or two D ) и протеомике (proteom *) в базе данных MEDLINE c 1975 по 2005 гг.
Протеомика в биологии
Эпигенетическая система отражает взаимодействие организма с окружающей средой, а также взаимодействия между генами и продуктами их деятеьности. Эти взаимодействия могут быть прямыми (рис. 3) или осуществляться посредством сложной сети взаимодействий на белковом уровне (рис. 4) В последнем случае, наличие дефекта в гене может приводить или не приводить к заболеванию; кроме этого, степень и тяжесть заболевания может изменяться в зависимости от индивидуума. В эти сложные взаимодействия также включается воздействия окружающей среды на организм.
https://pandia.ru/text/78/543/images/image006_30.jpg" width="377" height="337 src=">
Рис. 4. Схематическое изображение системы в которой между генотипом и фенотипом существуют комплексные взаимодействия на белковом уровне. Х –гипотетическое лекарственное средство; стрелки справа означают регуляторное воздействие лекарственного средства на фенотип (стрелка вверх – усиление экспрессии, стрелка вниз – подавление экспрессии специфические белки).
Известно, что только 2% болезней человека вызваны действием одного гена. Оставшиеся 98% заболеваний являются поли - или эпигенными по своей природе. Из этого утверждения следует то, что ни один ген не может действовать в одиночку. Он действует только в связи с другими генами а также с окружением. Гены могут экспрессироваться по-разному в разных организмах, а также ингибировать друг друга (явление, называемое эпистаз). Таким образом, для большинства полигенных заболеваний невозможно предсказать фенотип, исходя только из данных расшифровки генома.
Клетка реагирует на изменения внешней среды изменением ее белкового состава. В ответ на внешнее воздействие синтез одних белков увеличивается, других – уменьшается. Таким образом, фенотип не линейно зависит от проявлений генотипа, так как системы эпигенеза контролируют и модифицируют экспрессию генов. Практически все элементы эпигенетической системы – белки.
Молекулярный фенотип живой клетки невероятно лабилен. Многие белки имеют своей основной функцией перенос информации. Не существует фиксированного синтеза того или другого белка, поэтому концентрация белков в клетке изменяется. При обработке клетки гормонами, токсинами или лекарствами, количественные изменения наблюдаются не в одном, а в целом ряде белков. Существует два типа регуляции: up - и down-. Клетки – реактивные системы, в которых информация передается не только от генов к белкам, но и противоположном направлении (рис. 5).
https://pandia.ru/text/78/543/images/image009_22.jpg" width="378" height="378">Рис.5. Схема взаимодействия генома с окружающей средой.
Элиминация единичного белка в организме (например, в Knock-out мыши) приводит к изменению всего молекулярного фенотипа целого организма. Более того, любое лекарство, которое воздействует на белок, например, на ионный канал, опосредованно влияет на белковый состав всего организма.
Степень гликозилирования определяет биофизические свойства и биологическую активность молекулы белка. Гликозилирование – это посттрансляционная модификация, поэтому оно является основой гетерогенности белковой популяции. Попытки охарактеризовать гетерогенную популяцию гликозилированных белков предпринимались с использованием капиллярного электрофореза в тандеме с масс-спектрометрией.
Протеомика в медицине
В клинической биохимии анализ индивидуальных белков человека используется для установления вида патологического процесса (дистрофии, опухолевый рост, воспаление) и определения пораженного органа (инфаркт миокарда);
Установления природы патологии, например, при диагностике энзимопатий, инфекционных (гепатит) и других заболеваний;
Оценки течения различных физиологических процессов (беременность , развитие иммунной системы) и обнаружения осложнений в их течении (патология беременности).
В области разработки лекарств основной проблемой, как правило, является увеличение или уменьшение активности белков, поэтому необходим некоторый метод, позволяющий регулировать специфическую активность. 2Д электрофорез является основным средством изучения воздействия лекарств на протеом, или на совокупность всех белков органа. Как правило новые лекарства тестируются с помощью 2Д электрофореза, на накопление их в критических органах, например, в печени.
Пример 1. Лекарство ловастатин, понижающее уровень холестерола в крови. Специфика его действия заключается в ингибировании HMG-кофермент А редуктазы. Однако, при анализе эффекта, которое оказывает это лекарство в комбинации с другими средствами, понижающими холестерол, было найдено, что количество белка HMG-Кофермент-A синтазы значительно повышается, в то время как количество других белков уменьшаются. Позднее обнаружили, что основное действие изучаемого лекарства заключается не в прямом ингибировании синтеза холестерола, а в повышении активности другого белка, липопротеинового рецептора, который удаляет из крови холестерин.
Пример 2. Превентивное лекарство против рака олтипраз повышает экспрессию ряда белков, включая афлатоксин В1 альдегидредуктазу, который разрушает один из натуральных канцерогенов. Предполагалось, что эффект имеет место в эндоплазматическом ретикулуме. При анализе 2Д геля, однако, выяснилось, что большинство изменений происходит в растворимой и митохондриальной фракциях клетки. Кроме этого, при сравнении экстрактов печени самок и самцов, экспрессия более трети белков отличалась в количестве. Следует заметить, что почти все эти различия регулируются на гормональном эпигенетическом уровне и не обусловлены наличием Х или У хромосомы.
Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов в тканях очень пластична, отвечает на воздействия большого числа факторов и почти всегда включает не один или два, а много генов. 2Д электрофорез идеально подходит для изучения подобных динамических изменений.
Как правило, результаты 2Д коррелируют с известными механизмами функционирования белков. Так, если лекарство усиливает пролиферацию в пероксисомах по данным электронной микроскопии, то и на 2Д электрофорезе будет наблюдаться увеличение количества белков, характерных для этого типа органелл. Подобные структурно-функциональные взаимодействия означают, что идентификация белков-мишеней для нового лекарственного средства может помочь открыть механизмы функционирования этих белков.
Еще одна важная функция 2Д методов в клинической протеомике это поиск новых белков-маркеров заболеваний, в частности, онко-маркеров. Отмеченные в таблице 1 потенциальные маркеры рака простаты представляют особый интерес по разным причинам. Например, тимозин бета-15 может определяться в моче и, по-видимому, имеет прямое отношение к молекулярным механизмам злокачественного перерождения клеток. Соответственно, ген тимозина бета-15 и его продукты могут стать не только диагностическими маркерами, но и в перспективе мишенями для различных воздействий с целью подавления опухолевого роста.
Таблица 1.
Название маркера | Значимость для диагностики рака простаты (РП) |
1. Белок AGR2 (AGR2) | Секреторный белок, андроген-индуцируемый, обнаружен в РП, гиперэксперессия в 89% случаев РП. Обнаруживается при других опухолях |
2. Простат-специфический мембранный антиген | Маркер с прогностической значимостью. Высокий уровень коррелирует со злокачественностью и метастазированием, но определяется и при аденоме |
3. Тимозин бета 15 | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью «Мочевой» маркер, что перспективно при организации скрининга Обнаруживается при других злокачественных опухолях. |
4. Белок Р63 | |
5. Рацемаза (alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
6. Антиген простатных стволовых клеток (Prostate stem cell antigen, PSCA) | Маркер клеточных поверхностей, показана гиперэкспрессия гена при РП до 80%; высок уровень экспрессии при метастазах РП |
7. Высокомолекулярный цитокератин 34betaE12 (High-molecular-weight keratin 34betaE12) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
Методы
Комплексное изучение «протеома» проводится методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме).
1. Изоэлектрофокусированием (ИЭФ) называют разработанный в начале 60-х годов метод разделения белков под действием электрического поля в среде с градиентом pH, который создается специальными амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить ток (хорошая проводимость), а также создавать локально и поддерживать рН (хорошая буферная емкость). Появление наборов полиамино-поликарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет различий в pI.
2. Среди множества электрофоретических методов разделения белков наибольшая эффективность оказалась у особой модификации метода Лэммли для вертикальных пластин с градиентом концентрации полиакриламидного геля, использующего ионный детергент – додецилсульфат Na (SDS). За счет гидрофобных взаимодействий, используемый детергент практически одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1.4 мг SDS на 1 мг белка. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты делает несущественной роль заряда самого белка. Электрофоретическая подвижность комплекса белок-SDS в градиентном геле оказывается линейно связана с десятичным логарифмом его молекулярной массы (Mm). Таким образом, эта система обеспечивает разделение белков по различиям в Mm.
3. Идентификация миросеквенированием основана на определении (расшифровке) части аминокислотной последовательности белка. Разработанные методы микросеквенирования позволяют работать с очень малыми количествами пептидов - вплоть до нанограммовых. Это важно, так как определение даже короткого фрагмента аминокислотной последовательности часто оказывается решающим для идентификации целого белка. В настоящее время возможно как проведение прямого N-концевого секвенирования белка, перенесенного на инертную мемебрану, так и секвенирование отдельных пепетидов, полученных из изучаемого белка после его ферментативного расщепления высокоэффективной жидкостной хроматографией. Микросеквенирование позволяет выявлять одиночные аминокислотные замены в анализируеемых белках.
4. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет соотношение массы частицы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Различают несколько модификаций масс-спектрометрических методов:
· Мягкая матриксная ионизация (M atrix-A ssisted L aser D esorption/I onization - MALDI) позволяет анализировать такие биополимеры, как полисахара, пептиды и макромолекулы, без риска повредить их структуру. Ионизация производится лазерным пучком, а матрикс используется для защиты молекул от разрушающего действия лазера. Матрикс состоит обычно из кристаллов кислот в смеси с органическим растворителем.
· Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. Используется в идентификации белковых пятен после 2Д электрофореза.
5. Капиллярный электрофорез - это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты. Модификацией метода является капиллярный электрофорез в чипах. Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии может проводиться непосредственно после разделения.
6. Недавно был аннонсирован метод капиллярного изоэлектрофокусирования. После изофокусирования в канале чипа, покрытого специальной пленкой, чип замораживался, пленка удалялась и содержимое канала подвергалось высушиванию при критической точке для предотвращения изменения позиции белковых пятен. После этого матрикс для MALDI добавлялся непосредственно к содержимому чипа. В результате одновременно удавалось считывать информацию о молекулярном весе и изоэлектрической точке данного пептида.
7. Двумерный электрофорез:
При исследовании белков методом 2Д электрофореза, целью исследования является:
· обеспечить воспроизводимое разделение основных известных белков, характерных для данной ткани;
· показать присутствие известных минорных белков;
· выявить и идентифицировать маркерные белки, характеризующих известные изменения в данной ткани.
Для достижения цели решают следующие задачи:
1) Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа;
2) Проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры - комбинированное использование – двумерный гель-электрофорез (2D):
· Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по pI.
· Электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по Mm.
3) Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции белков (различные модификации масс-спектрометрии).
4) Стандартизированное описание белков на двумерных электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых одна из координат являться функцией молекулярной массы, а другая – изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей.
· Солюбилизация,
· подбор оптимальных условий
· Повышение разрешения – использование иммобилиновых стрипов
3. II направление (SDS PAGE)
· Повышение разрешения – увеличение размера геля
· Чувствительность,
· избирательность детекции/окраски
· Компьютерный анализ изображений
6. Вырезание отдельных белковых пятен
· Точность попадания
7. Идентификация белков
· Масс-спектрометрия
· Интерпретация данных
· Сравнение с другими базами данных
Создание протеома изучаемого объекта
Заключение
Современная протеомика имеет почти 30-ти летнюю историю, началом которой стали разработки метода двумерного электрофореза белков и создание системного подхода в исследованиях белковых продуктов генной экспрессии. Протеомика располагает внушительным методическим арсеналом и большими ресурсами по биоинформатике. Это позволяет надеяться, что прогресс в протеомных исследованиях человека (в сочетании с прогрессом в других областях функциональной геномики) качественно усилит потенциал современной клинической биохимии.
Протеомика является важнейшим источником новых знаний о белках человека, которые необходимы для клинической биохимии, поскольку на основе этих знаний формируются и детализируются представления о молекулярных основах различных болезней, а также расширяются диагностические возможности современной медицины.
Литература:
6. Остерман исследования белков и нуклеиновых кислот. Москва, Наука, 2002.
7. Карягина. Клинико-диагностическая интерпретация электро-фореграмм белков сыворотки крови. Учебно-методическое пособие. - СПб. Изд-во СПбГУ, 2000.
8. N. G.Anderson, N. L.Anderson. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis, (1996) 17, pp. 443-453.
9. Rob Haselberg ∗, Gerhardus J. de Jong, Govert W. Somsen. Capillary electrophoresis–mass spectrometry for the analysis of intact proteins. Journal of Chromatography, (20pp 81–109
10. Jurgen Cox and Matthias Mann. Is Proteomics the New Genomics? Cell 130, (2007) pp 395-398.
11. Wikipedia: http://en. wikipedia. org/
Протеомика - высокотехнологичная «рыбалка»
Мы живем в эпоху, которая регулярно обогащает язык массой новых слов, терминов и понятий. Области знания и информация, наполняющая их, множатся быстрее, чем возможности человека позволяют осознать этот процесс. «Протеомика» – новое направление науки, появившееся совсем недавно. Объектом ее изучения являются белки – «рабочие лошадки» любой клетки. Интерес к этим соединениям вызван не только их огромной ролью в функционировании живых организмов, но и тем, что они могут служить мишенями при создании новых лекарств
Слово «протеин», которым в научной литературе принято обозначать белок (высокомолекулярное органическое соединение, представляющее собой цепочку аминокислот), является производным от греческого proteios – «первоначальный». Его этимология точно описывает роль белков в поддержании жизни клетки любого организма – от бактерии до человека.
А вот термин «протеом» знаком, пожалуй, только специалистам. Интересно, что его придумал в 1994 г. австралийский студент М. Уилкинс, пытаясь в своей дипломной работе найти короткое название полному набору человеческих белков вместо неуклюжего словосочетания «все белки, экспрессируемые геномом». Уже на следующий год в научной печати появился термин «proteomics» (протеомика), обозначивший новое направление в молекулярной биологии (Wasinger et al. , 1995).
Следует отметить, что само предложение «создать молекулярный белковый атлас человека» было озвучено еще около тридцати лет назад (Anderson, 1985). Но в то время оно было, скорее, пожеланием, технологически невыполнимым. Что же изменилось за прошедшие десятилетия? Во-первых, была успешно реализована программа по геномике, включающая разработку технологий быстрого секвенирования ДНК, создание баз данных нуклеотидных последовательностей. Вторая предпосылка связана со взрывным развитием инструментальных методов: масс-спектрометрии белков и пептидов (небольших цепочек аминокислот), а также электрофореза и хроматографии, использующихся для разделения органических молекул.
Эти факторы сделали возможным появление новой «высокотехнологичной» биологической дисциплины.
Белковое изобилие
В отличие от геномов, протеомы , т. е. полные наборы белков клетки, представлены активным набором молекул, которые постоянно модифицируются. При этом, если биохимия имеет дело с отдельными выделенными молекулами, то в случае с протеомом мы имеем дело с огромным молекулярным пулом (уместно провести аналогию с рыбой, пойманной на удочку, и рыбным изобилием принесенным неводом).
Из этих положений вытекают цели и задачи науки протеомики. Прежде всего, эта дисциплина отвечает за белковую «систематику» – инвентаризацию всех белков, закодированных в геноме определенного организма, которая предполагает также и построение молекулярных белковых атласов отдельных клеток, органов и тканей.
Однако более интересна и намного более существенна задача (назовем ее «физиологической»), которая заключается в определении принципов взаимодействия между белками, а также в установлении закономерностей регуляции их работы при так называемой пост-трансляционной модификации (изменении) белков. Это важно для поиска новых маркеров патологических процессов (болезней) в организме человека.
Дело в том, что пост-трансляционная модификация белков происходит в клетке уже после их синтеза в ответ на какое-либо внешнее возмущение или болезнь. В результате свойства белков могут быстро измениться, что влияет на скорость их синтеза и деградации. В итоге результат таких процессов отразится на общем профиле белков. Изучая его, можно обнаружить белки, «производство» которых в состоянии болезни отличается от «здоровой нормы». Такие белки могут использоваться в диагностических целях в качестве биомаркеров того или иного заболевания.
Функциональная, структурная и медицинская
Протеомика – наука молодая, но исследования в этой области уже имеют хорошую организационную поддержку. В 2001 г. была основана «Human Proteome Organisation» (HUPO) – международная организация, которая объединяет и направляет усилия ученых.
Протеомика является классическим образцом междисциплинарной науки: она объединяет биологию, химию, компьютерное моделирование, сложную инструментальную технику
На официальной странице HUPO подробно изложены основные направления исследований, перечень которых может многое сказать даже неспециалисту: протеом человека, протеомика мозга, изучение антител, болезни, вызванные нарушениями метаболизма сахаров, протеомика сердечно-сосудистых заболеваний, протеомика стволовых клеток, определение биомаркеров заболеваний, изучение заболеваний человека на мышиных моделях и т. д.
Методологически в протеомике выделяют несколько направлений, главными среди которых являются функциональная, структурная и медицинская (клиническая) протеомика.
О целях функциональной протеомики уже упоминалось выше. Это получение информации о межбелковых взаимодействиях и их влиянии на экспрессию и модуляцию активности генов, а также пост-трансляционную модификацию белков в составе белковых комплексов.
Структурная протеомика, несмотря на то что является классическим направлением исследования белков, тем не менее, продолжает активно развиваться вследствие усовершенствования аналитических методов, таких как новые варианты ЯМР-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и масс-спектрометрии.
КАК МОЛЕКУЛЫ НАУЧИЛИСЬ «ЛЕТАТЬ»Современные масс-спектрометрические методы – инструментальная основа протеомики, метаболомики, фармакокинетики и других «-омик».
Что же измеряет масс-спектрометр? Строго говоря, он детектирует не массу молекулы, а соотношение m/z (соотношение массы иона к его заряду). В масс-спектрометре зачастую одни и те же молекулы могут иметь различные заряды и, соответственно, детектироваться в разное время. Понятно, что не имеющие заряда молекулы (нейтральные) не взаимодействуют с электрическим и (или) магнитным полем и для масс-спектрометра невидимы.
Вся история этой молодой науки пестрит именами Нобелевских лауреатов. Создателем первого масс-спектрометра заслуженно считают профессора Кембриджского университета Дж. Томпсона (Нобелевская премия по физике 1906 г.), который еще в самом начале XX в. века наблюдал изменения в движении ионов под действием электромагнитного поля. Основываясь на этих наблюдениях, он создал «параболический спектрограф», в котором молекулярные ионы двигались в электрическом поле по параболическим траекториям и детектировались по свечению люминесцентного экрана.
Эта работа была развита и усовершенствована коллегой Томпсона профессором Ф. Астоном, который за создание масс-спектрографа был удостоен Нобелевской премии по химии в 1922 г.
В это же время профессор Чикагского университета А. Демпстер работал над повышением эффективности ионизации молекул в масс-спектрометре. В 1918 г. он создал масс-спектрометр, в котором молекулы ионизировались под действием направленного потока электронов. Этот метод до настоящего времени является основным для ионизации небольших, легко летучих молекул. Сам же автор использовал прибор для определения изотопного состава элементов. Став полноправным участником «ядерной гонки», он в 1935 г. открыл изотоп урана 235 U. Его последователь – профессор Университета Миннесоты А. Ниер стал одним из ключевых участников Манхэттенского проекта: первая атомная бомба была создана из 235 U, выделенного Ниером с использованием масс-спектрометра.
Развитие и совершенствование методов разделения-идентификации молекулярных ионов велось в направлении создания физических моделей, позволяющих дискриминировать ионы по их характеристикам. Самый очевидный способ – позволить ионам лететь в вакууме и разделяться по скоростям, как производные массы молекулы. Так, в 1946 г. профессор Университета Пенсильвании У. Стефенс предложил время-пролетную масс-спектрометрию. Этот метод основан на том, что все ионы ускоряются электрическим полем и получают одинаковую кинетическую энергию. Скорость же каждого из них зависит от соотношения m/z, что позволяет легко их определять.
Альтернативный метод разделения молекулярных ионов в середине 1950-х гг. был предложен профессором Боннского университета В. Паулем. Он разработал метод разделения ионов в переменном электрическом поле, положив начало другому типу масс-спектрометров – ионной ловушке. Квадрупольная ловушка Пауля использует для удержания (разделения) ионов постоянные и переменные (радиочастотные) электрические поля. Хотя точность такого метода по сравнению с время-пролетным масс-спектрометром существенно ниже, он выигрывает в скорости сканирования и ширине динамического диапазона. Поэтому ионные ловушки являются идеальными детекторами для анализа в метаболомике, фармакологии, экологических исследованиях, а их создатель также удостоен Нобелевской премии по физике в 1989 г. (совместно с Х. Демельтом).
Масс-спектромер, основы конструкции которого были заложены в 20-х годах прошлого века, успешно используется и в настоящее время. Этот прекрасный лабораторный инструмент, способный очень точно характеризовать как химические элементы, так и небольшие органические молекулы, был и остается неизменным и безотказным помощником химиков-синтетиков.
С другой стороны, с помощью традиционных масс-спектрометров оказалось невозможным проводить анализ биологических макромолекул, поскольку биополимеры невозможно ионизовать и перевести в газообразное состояние нагреванием либо облучением пучков электронов. (Почти каждый из нас убедился в справедливости этого утверждения на своем опыте: яичница, забытая на плите, пригорает к сковородке, а не испаряется.)
Широкое использование масс-спектрометрии в изучении структуры и функций белков и пептидов стало возможным лишь благодаря технологическому прорыву, случившемуся в 1980-х гг., когда были разработаны новые, подходящие для биомолекул методы ионизации.
В 1983 г. команда профессора Йельского университета Дж. Фенна предложила метод ионизации электроспреем, в котором образование ионов достигалось путем распыления раствора образца при прохождении его через капилляр, на который подается высокое напряжение.
В это же время немецкая команда Ф. Хиленкампа предложила метод ионизации органических молекул путем облучения их высушенных образцов ультрафиолетовым лазером. При этом молекулы испарялись и ионизировались вместе с твердым летучим органическим веществом – матрицей. Это было рождение, пожалуй, самого популярного и востребованного в настоящее время метода биологической масс-спектрометрии – MALDI («Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization»).
Выбор вещества матрицы и подбор оптимального соотношения вещество/матрица обусловливает чувствительность метода за счет максимально эффективного перевода исследуемого вещества в газообразную фазу.
Уже через три года после публикации Хиленкампа сотрудник японской компании «Shimadzu» К. Танака предложил готовое решение для масс-спектрометрии белков массой до 100 кДа – время-пролетный MALDI масс-спектрометр. Справедливости ради нужно отметить, что используемые в нем матрицы были жидкими: белки растворялись в глицерине, в котором были взвешены микрочастицы металлического кобальта.
Эти работы отмечены Нобелевским комитетом в 2002 г.: Фенн и Танака разделили премию по химии за развитие мягких методов ионизации биомолекул в масс-спектрометрии.
В современных спектрометрах распространенным анализатором для MALDI является время-пролетный масс-спектрометр. Молекулярные ионы движутся в вакуумированной трубе, и детектора они достигают в порядке увеличения своей массы.
Эффективность получения (регистрации) ионов в MALDI масс-спектрометрии зависит от многих параметров: способа приготовления и очистки образца; количественного соотношения матрицы к анализируемому веществу и правильного выбора материала подложки. Важными условиями получения устойчивого сигнала являются мощность лазерного излучения, выбор «горячей точки» на образце, давление в области ионизации.
Для масс-спектрометров с электроспрейным ионным источником в качестве анализаторов наиболее часто используют ионные ловушки. В настоящее время сочетание квадруполя с электроспрейным источником ионов – один из наиболее часто применяемых инструментов в биохимии и метаболомике.
Оба масс-спектроскопических метода имеют свои достоинства и недостатки. Во-первых, для них требуется высокая химическая чистота анализируемого вещества. ESI является более «мягким» способом ионизации, чем MALDI. При ESI образуется непрерывный поток ионов, при MALDI – очень ограниченный во времени (до 10 нс) пакет ионов; при этом ESI-анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества, MALDI – в 10 раз меньше.
Но все эти замечания чисто технические и свидетельствуют лишь о том, что методы масс-спектрометрии биологических молекул сегодня стали доступны и широко используются в научных экспериментах и клинических исследованиях. Кроме того, сильные стороны этих методов хорошо дополняют друг друга, исполняя роль поистине мощного аналитического инструмента.
...К настоящему моменту история развития масс-спектрометрии насчитывает вторую сотню лет. Но лишь совсем недавно, как сказал Джон Фенн в своей Нобелевской лекции, «…молекулярные слоны смогли летать на ионных крыльях».
Медицинская протеомика – новая и перспективная область биомедицинских исследований, позволяющая адаптировать достижения функциональной протеомики, геномики и биоинформатики в буквальном смысле непосредственно «к жизни», т. е. использовать имеющиеся знания для клинического анализа биологических образцов, взятых у пациентов.
Современные достижения
Над поиском протеомных маркеров значимых заболеваний интенсивно работают исследователи всего мира – не только ученые из академических институтов, но и специалисты из исследовательских подразделений крупных и средних фармацевтических компаний.
Уже достигнуты определенные успехи в одной из самых проблемных областей медицины – ранней диагностике тяжелых заболеваний. В первую очередь это относится к раку предстательной железы (Downes et al. , 2007; Larkin et al. , 2010). Диагностика этого широко распространенного заболевания, проводящаяся по наличию в моче пациента белка простатспецифического антигена, – на сегодняшний день одна из самых ранних и точных.
К настоящему времени достигнуты неплохие результаты и в выявлении маркеров рака молочной железы (Mathelin et al. , 2006; Gast et al. , 2009). Из-за широкой клинической вариабельности этого заболевания в качестве маркеров предлагается использовать набор из 40 белков. Такой белковый профиль позволяет не только с высокой точностью диагностировать заболевание, но и прогнозировать эффективность лечения. Основные диагностические белки этого набора – гаптоглобин, трансферрин, аполипопротеины A-I и C-I – уже сегодня используются при диагностике рака молочной железы.
Ведутся исследования и по обнаружению маркеров нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, склерозов различной этиологии и т. д. (Cedazo-Minguez, Winblad, 2010). В этой области основными прогностическими маркерами являются ангиогенин (фермент, обеспечивающий рост кровеносных сосудов), креатининкиназа, фибриноген, аполипопротеин Е (Bowser, Lacomis, 2009)
В Сибири проблемами структурной и функциональной протеомики интенсивно занимаются в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. В результате совместной работы с НИИ Психического здоровья ТНЦ СО РАМН проведена большая работа по поиску белков-маркеров шизофрении.
Этиология и патогенез этой тяжелейшей психической болезни неизвестны. Согласно одной из теорий возникновения шизофрении, в основе заболевания лежит нарушение белкового обмена. Сравнение протеомных профилей статистически достоверной выборки людей, страдающих шизофренией, и протеомных профилей здоровых добровольцев уже позволило исследователям выявить опредленный набор белков в качестве маркеров: аполипопротеин A-II, фосфомевалонат киназу и сериновую (треониновую) киназу. Дальнейшие усилия ученых будут направлены на уточнение роли этих белков в патогенезе болезни и внедрение этих маркеров в клиническую биохимию.
У работы исследователей-протеомщиков огромный потенциал и перспективы. Учитывая то, что в организме человека число различных белковых молекул и их вариантов может составлять миллионы, ученые уверены, что их высокотехнологичная белковая «рыбалка» будет и в дальнейшем гарантированно приносить богатый улов. Успехи последних лет в этой новой биомедицинской области внушают обоснованный оптимизм.
Литература
Cox J., Mann M. Is proteomics the new genomics? // Cell. 2007. V. 130(3). P. 395-398.
Capelo J.L., Carreira R., Diniz M. et al. Overview on modern approaches to speed up protein identification workflows relying on enzymatic cleavage and mass spectrometry-based techniques // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 650. N 2. P. 151-159.
Ulrich-Merzenich G., Panek D., Zeitler H. et al. New perspectives for synergy research with the «omic»-technologies // Phytomedicine. 2009. N. 6-7. P. 495-508.
Feng X., Liu X., Luo Q., Liu B.F. Mass spectrometry in systems biology: an overview // Mass Spectrom. Rev. 2008. V. 6. P. 635-660.
А.А. ЗАМЯТНИН, доктор биологических наук, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
Наш рассказ будет посвящен одной из самых молодых фундаментальных наук (если не самой молодой), которая родилась всего лишь несколько лет назад вместе с теми, кто еще сейчас учится в начальной школе. В отличие от многих других наук о протеомике можно точно сказать, при каких обстоятельствах она возникла, указать год, когда появилось ее название и кто его придумал.
Начнем с обстоятельств. Во второй половине XX в. бурно развивались аналитические методы биохимии, молекулярной биологии и вычислительной техники. Выдающиеся успехи, достигнутые в этих областях, привели к возможности расшифровки огромных последовательностей оснований нуклеиновых кислот и к записи полного генома живого организма. Впервые полный геном был расшифрован в 1980 г. у бактериофага phi Х-174 (около 5·103 оснований), затем у первой бактерии – Haemophilus influenzae (1, 8·106 оснований) . А c завершением XX в. была закончена грандиозная работа по расшифровке полного генома человека – выявлению последовательности примерно 3 млрд оснований нуклеиновых кислот . На эту работу было затрачено несколько миллиардов долларов (примерно по одному доллару на одно основание). Всего же уже расшифрованы геномы нескольких десятков видов живых организмов. Именно в этот период возникли две новые биологические науки: в 1987 г. впервые в научной печати было использовано слово «геномика» , а в 1993 г. – «биоинформатика» .
У каждого биологического вида часть генома представлена участками, кодирующими аминокислотные последовательности белков. Например, таких участков у человека насчитывается порядка 100 000 (по некоторым оценкам, это число может достигать 300 000, а с учетом химически модифицированных структур – нескольких миллионов). Казалось бы, зная полный геном и генетический код, можно путем трансляции получить все сведения о структуре белков. Однако все не так просто. Постепенно становилось очевидным, что в данной рассматриваемой клеточной системе организма нет корреляции между наборами мРНК и белков. Кроме того, многие белки, синтезированные на рибосомах в соответствии с нуклеотидной последовательностью, после синтеза подвергаются химическим модификациям и могут существовать в организме в модифицированной и немодифицированной формах. И еще немаловажно то, что белки обладают разнообразными пространственными структурами, которые на сегодняшний день нельзя определить по линейным последовательностям нуклеотидов и даже аминокислот. Поэтому прямое выделение и определение структур всех функционирующих белков остается по-прежнему актуальной задачей (прямое определение структуры на сегодняшний день осуществлено примерно лишь для 10% белков человека). Так, в дополнение к геномике появился термин «протеомика», объектом исследования которой является протеом (от англ. PROTEins – белки и genOMe – геном). А в научной печати упоминание о протеоме впервые появилось в 1995 г. .
Следует добавить, что большую роль в жизнедеятельности организмов играют многочисленные короткие фрагменты белковых предшественников, которые называются олигопептидами, или просто пептидами. Именно из-за них наблюдается такой разнобой в оценке количества белково-пептидных компонентов у представителей одного биологического вида. Поэтому наряду с терминами «протеом» и «протеомика» в настоящее время уже употребляются такие термины, как «пептидом» и «пептидомика», представляющие собой часть протеома и протеомики. О многообразии структуры и функций белков и пептидов на страницах газеты «Биология» нами было рассказано ранее .
Итак, сформулируем определения новых наук, которые появились при жизни нынешнего молодого поколения и которые тесно взаимосвязаны друг с другом (рис. 1).
Рис. 1. Схема, иллюстрирующая полную взаимосвязь трех новых биологических наук
Геномика – наука, занимающаяся изучением структуры и функций генов (геном – совокупность всех генов организма).
Биоинформатика – наука, занимающаяся изучением биологической информации с помощью математических, статистических и компьютерных методов.
Протеомика – наука, занимающаяся изучением совокупности белков и их взаимодействий в живых организмах (протеом – совокупность всех белков организма).
Отметим также, что протеомика в общих чертах включает в себя структурную протеомику, функциональную протеомику и прикладную протеомику, которые мы рассмотрим в отдельности.
Структурная протеомика
Наиболее яркой особенностью биологии является разнообразие. Оно просматривается на всех уровнях биологической организации (биологические виды, морфология, химическая структура молекул, сеть регуляторных процессов и т.д.). В полной мере это относится и к белкам. Масштаб их структурного разнообразия до сих пор до конца не выявлен. Достаточно сказать, что число аминокислотных остатков в одном белке может составлять от двух (минимальная структура, имеющая пептидную связь) до десятков тысяч, а белок титин человека содержит 34 350 аминокислотных остатков и на сегодняшний день является рекордсменом – самой крупной из всех известных белковых молекул.
Чтобы получить сведения о протеоме, необходимо сначала его выделить и очистить от других молекул. Поскольку число белков во всем протеоме (т.е. во всем организме) весьма велико, обычно берут только часть организма (его орган или ткань) и различными методами выделяют белковую компоненту. За почти 200-летнюю историю изучения белков разработано множество методов выделения белков – от простого солевого осаждения до современных сложных методов, учитывающих различные физические и химические свойства этих веществ. После получения чистой фракции индивидуального белка определяется его химическая структура.
В структурной протеомике проводится определение структуры не одного, а сразу множества белков, и к настоящему времени для этого разработан специальный цикл процедур и создан арсенал соответствующих высокоточных приборов. (Полный набор оборудования для протеомных исследований стоит более одного миллиона долларов.)
Рис. 2. Инструменты протеомики
На рис. 2 приведена схема лабораторного цикла от приготовления образца до определения его структуры. После выделения и очистки (на рисунке представлен уже выделенный и очищенный препарат) с помощью двумерного электрофореза проводится разделение белков. Это разделение идет по двум направлениям: в одном разделяются молекулы белка, имеющие разную массу, в другом – различный суммарный электрический заряд. В результате этой тончайшей процедуры на специальном носителе одинаковые молекулы группируются, образуя макроскопические пятна, причем в каждом пятне содержатся только одинаковые молекулы. Число пятен, т.е. число разных белков или пептидов, может составлять многие тысячи (рис. 3, 4), и для их исследования используются автоматические устройства для обработки и анализа. Затем проводится отбор пятен и введение содержащихся в них веществ в сложнейший физический прибор – масс-спектрометр, с помощью которого и определяется химическая (первичная) структура каждого белка.
Рис. 3. Пример двумерной электрофореграммы белков из экстракта печени мыши
Рис. 4. Пример двумерной электрофореграммы пептидов из цереброспинальной жидкости человека
Рис. 5. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего сывороточный альбумин человека
Первичную структуру белка можно также определить, пользуясь результатами геномики и биоинформатики. На рис. 5 дана полная структура гена сывороточного альбумина человека. Она содержит 1830 азотистых оснований, кодирующих 610 аминокислотных остатков. Этот ген, как и абсолютное большинство других, начинается с кодона atg, кодирующего остаток метионина, и заканчивается одним из стоп-кодонов, в данном случае taa. Таким образом кодируется структура, состоящая из 609 аминокислотных остатков (рис. 6). Однако эта структура – молекула еще не сывороточного альбумина, а лишь его предшественника. Первые 24 аминокислотных остатка представляют собой так называемый сигнальный пептид, который при переходе молекулы из ядра в цитоплазму отщепляется, и только после этого образуется структура сывороточного альбумина, получаемая при выделении этого белка. В итоге данная молекула содержит 385 аминокислотных остатков.
Рис. 6. Аминокислотная последовательность предшественника сывороточного альбумина человека, транслированная с нуклеотидной последовательности с помощью генетического кода
Рис. 7. Пространственная (третичная) структура молекулы сывороточного альбумина человека
Однако аминокислотная последовательность не раскрывает пространственную структуру белка. С точки зрения термодинамики, вытянутая линейная структура энергетически невыгодна, и поэтому она специфическим для каждой последовательности образом сворачивается в уникальную пространственную структуру, которая может быть определена с помощью двух мощных физических методов – рентгеноструктурного анализа и метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии). С помощью первого из них определены пространственные структуры уже нескольких тысяч белков, в том числе и сывороточного альбумина человека, изображение которого представлено на рис. 7. Эта структура, в отличие от первичной (аминокислотной последовательности), называется третичной и в ней хорошо видны спирализованные участки, являющиеся элементами вторичной структуры.
Таким образом, задача структурной протеомики сводится к выделению, очистке, определению первичной, вторичной и третичной структур всех белков живого организма, а ее основными средствами являются двумерный электрофорез, масс-спектрометрия и биоинформатика.
Биоинформатика белков
Существование огромного количества разнообразных белков привело к необходимости создания информационных массивов – баз (или банков) данных, в которые заносились бы все известные о них сведения. В настоящее время существует множество общих и специализированных баз данных, которые доступны в Интернете каждому желающему. В общих базах содержатся сведения о всех известных белках живых организмов, т.е. о глобальном протеоме всего живого. Примером такой базы является SwissProt-TrEMBL (Швейцария–Германия), в которой на сегодняшний день содержатся структуры почти 200 000 белков, установленные аналитическими методами, и еще почти 2 млн структур, которые определены в результате трансляции с нуклеотидных последовательностей . На рис. 8 и 9 показано количество существующих белков, которые известны для каждого заданного числа аминокислотных остатков. Оси абсцисс на этих графиках ограничены 2000 остатков, но, как уже сказано выше, хотя и не часто, но встречаются и существенно более крупные молекулы. Из данных, представленных на рисунках, следует, что наибольшее число белков содержит по несколько сотен аминокислотных остатков. К ним относятся ферменты и другие достаточно мобильные молекулы. Среди более крупных белков много таких, которые выполняют опорную или защитную функции, скрепляя биологические структуры и придавая им прочность.
Рис. 8. Распределение известных (выделенных) белков по числу аминокислотных остатков
Рис. 9. Распределение транслированных аминокислотных последовательностей по числу минокислотных остатков
Рис. 10. Распределение известных природных олигопептидов по числу аминокислотных остатков
В глобальном протеоме особое место занимают небольшие очень подвижные молекулы, содержащие не более 50 аминокислотных остатков и обладающие специфическим спектром функциональной активности. Они называются олигопептидами, или просто пептидами. Для них, т.е. для глобального пептидома, создан особый банк данных, который называется EROP-Moscow. Это название представляет собой аббревиатуру от термина Endogenous Regulatory OligoPeptides (эндогенные регуляторные олигопептиды), и указывает на то, что банк создан и базируется в столице нашей страны . На сегодняшний день расшифрована структура почти 6000 олигопептидов, выделенных из представителей всех царств живого. Так же как и крупные белки, количество олигопептидов с заданным числом аминокислотных остатков можно изобразить графически (рис. 10). Судя по графику, чаще всего встречаются олигопептиды, содержащие примерно 8–10 аминокислотных остатков. Среди них в основном содержатся молекулы, которые участвуют в регуляции нервной системы, и поэтому называются нейропептидами. Очевидно, что самые быстрые процессы в живом организме осуществляются с участием нервной системы, поэтому пептидные регуляторы должны быть мобильными и следовательно небольшими. Однако, следует отметить, что, ввиду огромного структурного и функционального разнообразия как белков, так и пептидов, для них до сих пор не создано строгой классификации.
Таким образом, в данном случае задачами биоинформатики являются накопление информации о физико-химических и биологических свойствах белков, анализ этой информации, каталогизация и подготовка информационной базы и вычислительных средств для выявления механизмов их функционирования.
Функциональная протеомика
Наличие в организме того или иного белка дает основание предполагать, что он обладает (или обладал) определенной функцией, а весь протеом служит для того, чтобы осуществлялась полноценная жизнедеятельность всего организма. Функциональная протеомика занимается определением функциональных свойств протеома, и решаемые ею задачи существенно сложнее, чем, например, определение белково-пептидных структур.
Очевидно, что функционирование протеома осуществляется в многокомпонентной среде, в которой присутствует множество молекул других химических классов – сахаров, липидов, простагландинов, различных ионов и многих других, включая молекулы воды. Не исключено, что через некоторое время появятся такие термины, как «сахаром», «липидом» и им подобные. Белковые молекулы взаимодействуют с окружающими их другими или такими же, как и они, структурами, что в конечном итоге приводит к возникновению функциональных реакций сначала на молекулярном уровне, а затем и на макроскопическом. Уже известно множество таких процессов, в том числе с участием белков. Среди них взаимодействие фермента с субстратом, антигена с антителом, пептидов с рецепторами, токсинов с ионными каналами и т.д. (рецепторы и ионные каналы также являются белковыми образованиями). Для выявления механизмов этих процессов проводятся как экспериментальные исследования индивидуальных участников взаимодействия, так и системные исследования средствами биоинформатики. Рассмотрим несколько примеров таких системных подходов.
На рис. 11 показаны представители протеома (в данном случае пептидома) человека – различные гастрины и холецистокинины, которые локализованы в желудочно-кишечном тракте (при написании аминокислотных последовательностей использован стандартный однобуквенный код, расшифровка которого была дана нами ранее ). Функциональными частями молекул этих пептидов являются очень схожие правые области. Однако пептиды обладают прямо противоположными поведенческими свойствами: гастрины вызывают у человека ощущение голода, а холецистокинины – сытости. По-видимому, данное различие обусловлено тем, что в первичной последовательности холецистокининов положение остатка тирозина Y сдвинуто на один шаг по сравнению с гастринами. На том же рисунке приведена первичная структура пептида ционина, полученного из представителя простейших хордовых Ciona intestinalis (рис. 12). Его структура гомологична и гастринам, и холецистокининам и характеризуется двумя остатками тирозина, находящимися в тех же положениях, что и у обоих указанных пептидов. К сожалению, функциональные свойства его не изучены. А при должном экспериментальном исследовании можно было бы ответить на вопрос, какова роль химической структуры в целом и остатков тирозина в частности при проявлении противоположных физиологических эффектов.
Рис. 11. Первичные структуры представителей пептидома человека в сравнении со структурой одного из пептидов оболочечника
Рис. 12. Оболочечник Ciona intestinalis, обитающий в Северном море
Другой пример: на рис. 13 приведены аминокислотные последовательности очень похожих молекул, которые также объединены в структурно-гомологичное семейство. Эти молекулы обнаружены у весьма эволюционно далеких живых организмов – от насекомых до млекопитающих. В первой строке дана первичная структура брадикинина, содержащего 9 аминокислотных остатков и встречающегося у многих высших организмов, в том числе и у человека. В течение многих лет химики синтезировали различные неприродные аналоги этой молекулы, чтобы ответить на вопрос, какой ее участок ответственен за взаимодействие с рецептором. Около 30 лет назад были даже синтезированы все возможные фрагменты брадикинина – 8 дипептидов, 7 трипептидов и т.д. (всего возможны 36 фрагментов), величину активности которых затем испытывали в одном и том же биологическом тесте. Результат оказался тривиальным: выяснилось, что максимальную активность проявляет лишь вся молекула целиком, а каждый фрагмент по отдельности обладает либо следовой активностью, либо нулевой. Эту трудоемкую работу не пришлось бы делать, если бы в то время были известны другие брадикинины, приведенные на рис. 13, и средствами биоинформатики они были бы выделены из глобального протеома. Представленное структурно-гомологичное семейство наглядно демонстрирует, что у всех молекул есть область, которая в результате биологической эволюции практически не изменялась (квазиконсервативная область), и она представляет собой молекулу брадикинина высших живых организмов, отобранную как наиболее совершенную в результате эволюционного процесса. Данный пример демонстрирует, что протеомика вместе с биоинформатикой позволяет быстро (и дешево) решать принципиальные научные проблемы.
Рис. 13. Первичные структуры природных пептидов брадикининов, полученных из разных живых организмов. Жирным шрифтом указаны квазиконсервативные области
Рис. 14. Первичные структуры структурно-гомологичного семейства эндотелинов / токсинов
И, наконец, третий пример – структурно-гомологичное семейство эндотелинов млекопитающих и токсинов змей (рис. 14). Несмотря на поразительное сходство структур, их функциональные свойства разительно отличаются друг от друга: одни являются очень полезными регуляторами сосудистого сокращения, а другие – смертельно опасны для жизни. В данном случае мы сталкиваемся с ситуацией, когда первичная структура не несет достаточной информации, способной объяснить причину различия функций, и необходимо более детальное рассмотрение пространственной (третичной) структуры. На рис. 15 и 16 показаны пространственные структуры двух представителей этого семейства – эндотелина-1 и сарафотоксина 6b, полученные с помощью ЯМР-спектроскопии. На рисунках они повернуты так, чтобы достичь максимальной пространственной гомологии. Но полной гомологии не удается получить ни при каком повороте. Следовательно, несмотря на большое сходство первичных структур, взаимодействие их осуществляется с разными рецепторными структурами, а потому и приводит к разным физиологическим эффектам.
Рис. 15. Пространственная структура сосудосокращающего пептида эндотелина-1 человека
Рис. 16. Пространственная структура сарафотоксина 6b израильской змеи Atractaspis engaddesis
Конечно столь частными примерами невозможно полностью охарактеризовать многообразие функциональной протеомики. Создание представлений об огромной сети взаимодействий белковых и других молекул в организме требует огромного труда и применения всех средств современной биоинформатики. По существу, создание таких представлений еще только начинается. Однако есть основание полагать, что с каждым годом наши познания в этой области будут быстро расти.
Рис. 17. Общие контуры карты метаболизма карбоновых кислот
Одним из первых успехов на этом пути является создание карты метаболизма карбоновых кислот в Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (рис. 17). Эта карта представляет собой сеть реакций с регулярным периодическим строением. Такой подход оказался успешным ввиду того, что функционально аналогичные метаболиты претерпевают сходные биохимические превращения, образуя функционально аналогичные производные. В карте по вертикали расположены области, содержащие соединения с одинаковым числом атомов углерода (от 1 до 10), а горизонтальные ряды представляют собой ряды функционально аналогичных метаболитов. Химические структуры на карте соединены многочисленными стрелками с указанием, какие ферменты (белки) участвуют в соответствующих химических превращениях. Не правда ли, такой подход напоминает периодическую систему химических элементов Д.И. Менделеева? И так же, как и менделеевская система, данная карта обладает прогностической силой. С ее помощью был предсказан целый ряд новых ферментов, которые впоследствии были обнаружены экспериментально.
Подобные схемы могут быть распространены и на другие метаболические процессы (например, углеводов, аминокислот и т.д.), а также использованы для поиска новых метаболитов биохимических реакций.
Таким образом, функциональная протеомика занимается изучением сложных взаимосвязей структуры и функций протеома.
Практическая протеомика
Итак, главной задачей протеомики является выявление механизма взаимодействия огромного числа белков и пептидов в одном организме. Какова же практическая значимость этой грандиозной и дорогостоящей работы? Очевидно, что в первую очередь в результатах такой работы заинтересованы фармакологи и медики, поскольку очень часто прослеживается тесная связь между изменениями в белковом составе и болезненным состоянием человека. Поэтому новые данные в протеомике будут использоваться (и уже используются) для быстрой разработки новых лекарственных средств и новейших методов лечения болезней, с которыми медицина боролась веками. На сегодняшний день 95% всех фармакологических средств воздействуют на белки. Протеомика со своим системным подходом может помочь идентифицировать и оценить важность появления новых белков гораздо эффективнее, что, в свою очередь, ускорит разработку новых диагностических тестов и терапевтических средств.
Первое практическое применение протеомных исследований состоялось задолго до появления термина «протеомика», еще в начале XX в., когда была обнаружена роль инсулина в развитии такого тяжелого заболевания, как диабет. Создание инсулиновых препаратов спасло жизнь миллионам людей.
В настоящее же время протеомика, вместе с геномикой и биоинформатикой, ориентирована на создание новых лекарственных препаратов (рис. 18), в которых молекулярными мишенями будут служить те или иные белки . Процесс нахождения новых мишеней для действия лекарств решается с помощью биоинформатики, причем объектом анализа является геном. Однако после анализа генома необходимо получить доказательства того, что данный белок интенсивно экспрессируется и находится в клетке в рабочем состоянии. Эту задачу решает протеомика. Таким образом выявляется молекулярная генетическая мишень для лекарства.
Рис. 18. Взаимосвязь геномики, протеомики и биоинформатики при решении проблемы конструирования новых лекарственных средств
Следует отметить, что протеомика может и сама по себе решать проблему нахождения мишени. Если получить протеомные карты (подобные тем, что представлены на рис. 3 или 4) нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики. Можно предположить, что в будущем к обычному анализу крови добавится создание протеомных карт крови. Для этого в поликлиниках необходимо будет использовать специальное оборудование, с помощью которого у пациентов периодически будут брать кровь. При возникновении болезненного состояния протеомную карту больного человека нужно будет всего лишь сравнить с его же протеомной картой, но составленной в то время, когда он был здоров, и можно будет выявить произошедшие изменения в белковом составе крови и определить причину заболевания. Подобное сравнение протеомов опухолевых и нормальных клеток, клеток до и после воздействия определенных факторов (например, физических или химических), использование биологических жидкостей в диагностических целях – все это представляет огромный интерес и открывает совершенно новые перспективы для медицины, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности и других прикладных областей. Впереди предстоит огромная и интересная работа.
Список литературы
1. Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. et al. Nucliotide sequence of bacteriophage phi X-174 DNA.//Nature. 1977. V. 265, № 5596. P. 687–695.
2. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, № 5223. P. 496–512.
3. Nature. 2001. 409, № 6822 (большая часть выпуска журнала посвящена расшифровке генома человека).
4. Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. The genomics of human homeobox-containing loci.//Pathol. Immunopathol. Res. 1988. V. 7, № 1–2. P. 119–126.
5. Franklin J. Bioinformatics changing the face of information.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. P. 145–152.
6. Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.//Electrophoresis. 1995. V. 16, № 7. P. 1090–1094.
7. Замятнин А.А. Блистающий мир белков и пептидов.//Биология. 2002. № 25–26. P. 8–13.
8. Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.//Proteomics. 2004. V. 4, № 12. P. 3665–3685.
9. Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry.//FEBS Lett. 2004. V. 567, № 1. P. 92–95.
10. http://au.expasy.org/sprot/
11. http://erop.inbi.ras.ru/
12. Малыгин А.Г. Метаболизм карбоновых кислот (периодическая схема). – М.: «Международная программа образования», 1999.
Функциональная геномика тесно соприкасается и фактически перекрывается с новейшим направлением биологии, получившим название "протеомика " - наука о протеомах. Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова "геном", так что в самом названии как бы слиты воедино «белок» и «геном» (ДНК). Это подчеркивает их теснейшую взаимосвязь. Однако, между геномикой и протеомикой, между геномом и протеомом есть одно фундаментальное различие, которое вызывает к жизни совершенно новые ме- тоды исследования, новые стратегии.
Протеом - понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению, обеспечить сохранение видов и т.д. Изменчивость генома всегда происходит на фоне его высокой стабильности и ни в коей мере ее не отменяет. Протеом - набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени, т.е. меньше генома по общему объему информации. В любой клетке человеческого организма никогда не функционируют все примерно 80 тыс. генов, работает лишь их часть - иногда меньшая, иногда большая. Хотя точные цифры привести пока трудно, но в обычной специализированной клетке, например, в клетке печени или легкого, одновременно присутствуют, вероятно, не более 10 тыс. белков, причем, в резко различных количествах - от нескольких молекул на клетку до нескольких процентов общего клеточного белка. Набор белков постоянно меняется в зависимости от фазы клеточного деления, тканевой специализации клетки, стадии ее дифференцировки, принадлежности к нормальным или злокачественным клеткам, состояния стресса или покоя, воздействия внеклеточных физиологически активных веществ и так до бесконечности. Поэтому белковый "портрет" клетки зависит от множества факторов и воздействий, подвержен практически непрерывным изменениям, что делает его изучение особенно трудным.
Существует «букет» протеомных технологий; каждая имеет свои достоинства и недостатки. Остановимся на двух, наиболее эффективных. Сложную смесь белков, экстрагированных из клетки, можно подвергнуть разделению на носителе (обычно это полиакриламидный гель) в двух направлениях: в одном-белки будут делиться по размерам (молекулярной массе), в другом - по электрическому заряду (изоэлектрической точке). В результате, получается двумерная, карта, содержащая многие сотни точек, каждая из которых соответствует одному или нескольким белкам.
Если исследователя интересует какая-то группа белков, можно ее выделить на «карте» и подвергнуть повторному разделению в несколько измененных условиях с более высоким разрешением. Сейчас в банках данных хранится информация о множестве разных типов клеток, белки которых были подвергнуты электрофоретическому разделению в двух направлениях. Компьютер умеет сравнивать такие двумерные «белковые карты» и вычленять то, что у этих типов клеток одинаково, а по каким белкам они различаются.
Метод «двумерных карт» непрерывно совершенствуется, и большинство индивидуальных белковых точек, которые видны на этих «картах», уже идентифицированы или находятся в процессе идентификации.
Наиболее современный метод идентификации белков состоит в том, что исследуемый белок подвергают расщеплению на фрагменты (пептиды) с помощью того или иного фермента (протеазы). Затем полученные пептиды разделяют, обычно с помощью хроматографии под высоким давлением, а потом каждый из индивидуальных пептидов помещают в масс-спектрометр и узнают его массу. Сравнение полученных результатов с имеющимися в базах данных по белкам позволяет надежно опознать белок, если его структура известна. Для неизвестного белка этот метод помогает найти "родственников", а следовательно, сформулировать предварительное представление о его возможной функции.
Изменчивость протеома связана не только с тем, что в данный момент времени работает одна часть генов, а в другой момент - иная. Набор белков сильно зависит от процессов, протекающих на пути от ДНК к матричной РНК (мРНК). Здесь большая часть первичных генных продуктов (РНК) подвергается так называемому «альтернативному сплайсингу», суть которого состоит в том, что до образования зрелой матричной РНК из нее удаляются разные части молекулы. В результате, один ген может породить множество белков, различающихся первичной структурой. Таким образом, стало очевидно, что одна из старых догм биохимии и молекулярной биологии - "Один ген - один фермент" - нуждается в модернизации. Для очень многих случаев справедлива формула: "Один ген - много белков".
В этой связи, необходимо отметить, что после синтеза, белки претерпевают множество химических изменений (модификаций), которые создают их огромное разнообразие, хотя исходно они кодированы одним геном. К числу таких модификаций относятся реакции фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многие другие. Если учесть, что на большом белке есть множество мест, где эти модификации могут происходить, то легко себе представить, какое практически бесконечное разнообразие форм одной и той же белковой молекулы может возникнуть. Подавляющее большинство модификаций существенно сказывается на биологической активности данной молекулы белка, а также на ее способности взаимодействовать с другими белковыми молекулами. В итоге, мы приходим к заключению, что когда в клетке работает, скажем 10% всех генов – допустим, 8 тыс., - то количество разных белков может превысить эту величину в 10 раз. Исследователи и раньше догадывались, что такая ситуация возможна, однако, только теперь реально представляют ее истинные масштабы.
Крайне важным разделом протеомики, безусловно, следует считать изучение белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий. В течение жизни клетки практически каждый белок при своем функционировании взаимодействует с множеством макромолекул, а также низкомолекулярных лигандов.
Для изучения белок-белковых взаимодействий в последние годы получил широчайшее распространение метод так называемых «дрожжевых двойных гибридов». С помощью генной инженерии создается конструкция, которая состоит из участка ДНК, взаимодействующего с фактором транскрипции, и участка ДНК, кодирующего «ген-репортер», который в свою очередь кодирует белок-фермент, активность которого легко измерить. Фактор транскрипции состоит из двух доминантов и работает только в том случае, когда доминанты взаимодействуют друг с другом. Если надо узнать, взаимодействуют ли два исследуемых белка друг с другом, нужно отчленить фактор транскрипции и к каждому из доминантов присоединить по интересующему нас белку. При их взаимодействии фактор транскрипции восстановит свою активность, что позволит работать «гену-репортеру», и тогда вы обнаружите активность «репортерного белка». Если исследуемые белки не взаимодействуют, белок-фермент не образуется.
Применение двугибридной системы к белкам человека и других организмов позволило доказать, что существует огромное число белок-белковых контактов самого разного типа и, кроме того, обнаружить множество ранее неизвестных белок-белковых взаимодействий. Эта информация исключительно важна для идентификации компонентов сигнальных путей в клетке. Как правило, в передаче сигналов от поверхности клетки к ядру участвуют «белки-посредники», часто находящиеся в клетке в ничтожных концентрациях, поэтому анализ сигнальных путей для экспериментаторов сильно затруднен. Выявление белок-белковых взаимодействий резко изменило ситуацию.
При анализе белок-нуклеиновых взаимодействий широко используют методы «химической сшивки» этих компонентов (например, сотрудниками академика А.А. Богданова выявлены многие важные взаимодействия внутри рибосомных частиц, где осуществляется биосинтез белков в клетке).
Другой удобный метод - изменение электрофоретической подвижности при комплексообразовании, с помощью которого проанализировано множество ДНК-белковых и РНК-белковых контактов. Оригинальный вариант этого метода в сочетании с «химической сшивкой» разработан академиком А.Д. Мирзабековым и применен для раскрытия структуры нуклеосомы - элементарной структурной единицы, состоящей из ДНК и белков-гистонов, из которых построены все хромосомы.